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張孝兵/程濤/張磊首次揭示CRISPR-Cas9核糖核蛋白聯合AAV供體進行基因編輯動力學修復機制
2021.04.16

近年來,基因治療、免疫治療和再生醫學等領域不斷取得重大突破。經CRISPR技術進行基因編輯後的人多潛能幹細胞iPSC,經過基因修飾、可靶向識別腫瘤的CAR-T細胞等具有重要臨牀應用價值,但由於這些細胞基因編輯效率(特別是HDR或精準基因插入效率)有限,阻礙其在臨牀上的廣泛使用[1,2]。因此,探究細胞基因編輯後動力學修復機制,並有效提高HDR效率,是細胞治療應用於臨牀需要解決的一個瓶頸問題。

2021年125日,中國醫學科學院血液病醫院(中國醫學科學院血液學研究所)實驗血液學國家重點實驗室張孝兵/程濤/張磊團隊在《核酸研究》雜誌發表題爲「Dynamics and competition of CRISPRCas9 ribonucleoproteins and AAV donor-mediated NHEJ, MMEJ and HDR editing」的研究論文,首次揭示了CRISPR-Cas9核糖核蛋白聯合AAV供體進行基因編輯後NHEJMMEJHDR各編輯結果間動力學競爭關係。

DNA雙螺旋結構斷裂後,細胞會立即啓動DNA損傷修復機制,主要包括經典的非同源末端連接(c-NHEJ/NHEJ)、非傳統的末端連接或微同源介導的末端連接(alt-EJ/MMEJ)和同源模板指導的精確修復(HDR)等[3]DNA斷裂修復過程可能會破壞基因的開放閱讀框,造成等位基因敲除。在提供HDR模版的情況下,可實現基因的精確敲入。目前,HDR供體主要包括質粒、單鏈寡脫氧核糖核苷酸(ssODN)和AAV等。

使用RNP和AAV6 HDR供體模板進行精確HDR編輯的示意

作者在成人外周血重编程来源的iPS細胞、原代T細胞、人慢性髓性白血病細胞株K562細胞和單核白血病細胞株U937等四種細胞類型中,對超過80個位點進行基因編輯,然後在不同的時間點收集細胞,PCR擴增編輯位點臨近序列,進行高通量測序分析,獲得編輯模式的詳細圖譜(上圖)。結果表明,不同導向RNAgRNA)、不同細胞類型間基因編輯效率和模式存在明顯差異。將RNP電轉後5個連續時間點的各個代表性DNA修復情況的頻率繪製成圖,取效率達到最大值的一半(50%)時的時間數值作爲該編輯情況的T50,統計分析得出在四種細胞中各個代表性修復途徑的發生速度。作者發現CRISPR-Cas9基因編輯後,NHEJ的發生速度最快,接下來是HDR,而MMEJ修復最慢,這就解釋了基因編輯後經常發生高比例A/T(腺苷酸或胸腺嘧啶)插入的原因。當提供AAV6 HDR供體模版時,MMEJ介導的長片段缺失顯著減少,但NHEJ介導的插入缺失不受影響。

由于NHEJ是修復DNA斷裂損傷最主要且快速的修復途徑,一定程度上阻礙了HDR的發生,作者期望尋找有效的NHEJ抑制劑提高HDR的效率。經過對14種小分子藥物及其不同組合的測試,首次報導兩種小分子M3814NHEJ抑制劑)和Trichostatin ATSAHDAC抑制劑)的組合能夠有效抑制NHEJ,提高了期望的HDR編輯結果。M3814+TSA這種小分子化合物組合適用於多種細胞(在人iPSCT細胞中提高HDR效率24倍)以及多種模板載體(質粒載體及AAV載體)。

总之,该研究首次揭示了CRISPR RNP-AAV系統基因編輯後NHEJMMEJHDR各編輯結果間動力學競爭關係,利用M3814+TSA小分子組合抑制NHEJ+A/T將成爲多種細胞類型中提高HDR效率的通用策略,從而實現CRISPR基因編輯技術的普遍應用。

中國醫學科學院血液病醫院(中國醫學科學院血液學研究所)實驗血液學國家重點實驗室張孝兵教授、程濤教授和血栓止血診療中心張磊教授是本文的共同通訊作者。中國醫學科學院血液病醫院(中國醫學科學院血液學研究所)博士生傅雅文、代新岳和助理研究員王文天爲本文的共同第一作者。

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[1] Kim, M.Y., Yu, K.-R., Kenderian, S.S., Ruella, M., Chen, S., Shin, T.-H., Aljanahi, A.A., Schreeder, D., Klichinsky, M. and Shestova, O. (2018) Genetic inactivation of CD33 in hematopoietic stem cells to enable CAR T cell immunotherapy for acute myeloid leukemia. Cell, 173, 1439-1453. e1419.

[2] Lu, Y., Xue, J., Deng, T., Zhou, X., Yu, K., Deng, L., Huang, M., Yi, X., Liang, M., Wang, Y. et al. (2020) Safety and feasibility of CRISPR-edited T cells in patients with refractory non-small-cell lung cancer. Nat Med, 26, 732-740.

[3] Chapman, J.R., Taylor, M.R. and Boulton, S.J. (2012) Playing the end game: DNA double-strand break repair pathway choice. Mol Cell, 47, 497-510.

撰稿:代新岳

编辑:柴子越

校对:徐龙彪

审核:祁健伟  周家喜